缬氨酸分子量(【消化疾病研究】IL-10RA外显子区域rs2228055位点基因多态性与儿童食物过敏易感性的关系)

缬氨酸分子量
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本文刊于：中华儿科杂志,2020,58 (07): 559-563

DOI：10.3760/cma.j.cn112140-20200425-00433

作者：孙晋波 李在玲

单位：北京大学第三医院儿科

通信作者：李在玲
Email：topbj163@sina.com
摘要目的  探讨白细胞介素10受体A（IL-10RA）外显子区域rs2228055位点基因多态性与儿童食物过敏易感性的关系。
方法  病例对照研究。选择2017年8月1日至2018年11月30日在北京大学第三医院儿科食物过敏门诊被诊断为食物过敏的150例患儿作为食物过敏组，选择同期在北京大学第三医院儿童健康发展中心健康体检的150名儿童作为对照组。用PCR重测序的方法检测两组儿童rs2228055位点基因型，比较两组儿童该位点基因型及等位基因频率，同时比较该位点基因型及等位基因频率在过敏原特异性IgE阳性与IgE阴性的食物过敏患儿、在食物过敏患儿不同器官系统表现中的分布。采用计算机虚拟突变rs2228055位点等位基因改变后引起的氨基酸改变，分析氨基酸改变后对IL-10RA结构的影响。组间比较采用χ2检验。
结果  （1）食物过敏组男92例、女58例，对照组男86名、女64名，组间比较差异无统计学意义（χ2=0.497，P=0.481），食物过敏组和对照组年龄分别为4.2（0.1~15.0）岁、8.0（0.1~14.0）岁，组间比较差异有统计学意义（Z=-6.109，P<0.01）。（2） rs2228055位点基因型在食物过敏组与对照组分别为AA 73例（48.7%）、98例（65.3%）；AG 62例（41.3%）、42例（28.0%）；GG 15例（10.0%）、10例（6.7%）；等位基因频率在两组分别为A 208（69.3%）、238（79.3%）；G 92（30.7%）、62（20.7%），食物过敏组患儿AG及GG基因型及等位基因G频率高于对照组儿童（χ2=8.501、7.862，P=0.014、0.005）。（3）rs2228055位点基因型及等位基因频率在过敏原特异性IgE阳性和阴性组食物过敏患儿中分布差异无统计学意义（P均>0.05）。（4）rs2228055位点基因型及等位基因频率在有皮肤表现和无皮肤表现、有消化系统表现和无消化系统表现、有呼吸系统表现和无呼吸系统表现的食物过敏患儿中分布差异无统计学意义（p均>0.05）。（5）计算机虚拟突变发现，当rs2228055位点所编码的氨基酸由异亮氨酸转变为缬氨酸后，其突变能为-0.08，IL-10RA的稳定性没有增加。
结论  食物过敏患儿IL-10RA外显子区域rs2228055位点基因型AG、GG及等位基因G频率高于对照组儿童，携带等位基因G的儿童更容易发生食物过敏。

食物过敏是指摄入某种食物后引起的可重复出现的异常免疫反应。白细胞介素10(interleukin 10,IL-10）可以通过促进Foxp3+调节性T细胞（Foxp3+ regulatory T cell, Foxp3+Treg）产生抑制抗原特异性CD4+T增殖抑制过敏反应。IL-10与IL-10受体（interleukin-10 receptor，IL-10R）结合发挥生物学作用，IL-10R包括IL-10RA和IL-10RB，其中IL-10RA能特异性与IL-10结合。IL-10RA结构异常会影响其与IL-10的结合。IL-10RA外显子区域基因多态性可能会通过影响其结构而影响其功能。本研究通过比较IL-10RA外显子区域rs2228055位点基因型及等位基因频率在食物过敏儿童和对照儿童中的分布，分析该位点与儿童食物过敏易感性的关系。

对象和方法一、对象病例对照研究。选择2017年8月1日至2018年11月30日在北京大学第三医院儿科食物过敏门诊被诊断为食物过敏的150例患儿作为食物过敏组，选择同期在北京大学第三医院儿童健康发展中心健康体检的150名儿童作为对照组。根据参考文献[5,6]制定入组、排除标准。（1）食物过敏组需同时具备以下4项标准：①年龄1~16岁，中国北方汉族；②回避可疑引起过敏的食物后食物过敏症状减轻或消失，再次引入可疑食物后食物过敏症状加重或再次出现；③具备睡眠不佳、哭闹不安、焦虑、情绪低落、皮疹、流涕、打喷嚏、咳喘、呕吐、腹泻、便血等1种或多种表现；④过敏原特异性IgE、食物激发试验、皮肤点刺试验一项或多项阳性。排除标准：①患过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、哮喘等过敏性疾病；②无食物过敏相关表现；③患有急慢性疾病，如感染性疾病、肝肾功能不全、血液系统疾病、自身免疫性疾病、遗传代谢性疾病等。（2）对照组需同时具备以下2项标准：①年龄1~16岁，中国北方汉族；②无食物过敏相关临床表现。排除标准：①既往有食物过敏但入组时已经耐受；②患有急慢性疾病，如感染性疾病、肝肾功能不全、血液系统疾病、自身免疫性疾病、遗传代谢性疾病等。本研究获得北京大学第三医院医学科学研究伦理委员会批准[（2016）医伦审第（057-03）号]，所有儿童家长均签署知情同意书。二、方法1．收集资料：收集两组儿童的年龄、性别、既往史、临床表现、实验室检查等资料。食物过敏组根据过敏原特性IgE结果分为过敏原特异性IgE阳性组和阴性组；根据临床表现分为有皮肤表现和无皮肤表现组、有消化系统表现和无消化系统表现组、有呼吸系统表现和无呼吸系统表现组。验证rs2228055位点基因型在食物过敏组和对照组是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，比较该位点基因型及等位基因频在各组间分布。
2．PCR重测序：
由北京六合华大基因公司完成。采集食物过敏组及对照组儿童外周乙二胺四乙酸盐抗凝静脉血2 ml。按DNA提取试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）说明书中步骤提取DNA。正向引物序列为5′CAGCCCTCAAGTCTCA TGGT3′，反向引物序列为5′TCCCAGACCCTT TAGT3′。PCR反应条件为预变性96 ℃ 5 min，变性96 ℃ 20 s，退火52 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，共10个循环，然后变性96 ℃ 20 s，退火52 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，共35个循环，最后延伸72 ℃ 5 min。PCR产物测序反应循环程序为95 ℃ 15 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 90 s，共35个循环。
3．计算机虚拟氨基酸改变：
用Discovery Studio 2018 (DS2018）计算机软件，通过Prepare Protein模块对IL-10RA的晶体结构进行预处理，并赋上CHARMm力场。选择Single Mutation模块将rs2228055位点等位基因由A变为G后的IL-10RA第224位氨基酸虚拟突变为缬氨酸，并通过Calculate Mutation Energy模块计算氨基酸突变能量。突变能在-0.5到+0.5为对结构稳定性无影响，突变能在+0.5以上为减少结构稳定性，突变能在-0.5以下为增加结构稳定性。
       三、统计学处理应用SPSS 23.0统计学软件进行数据处理，非正态分布的计量资料以M（范围）表示，组间比较采用非参数检验，计数资料以例（%）表示。不同组间性别、等位基因、基因型频率的差异及Hardy-Weinberg平衡检测采用χ2检验。应用二分类Logistic回归分析检验年龄因素对两组儿童等位基因频率的影响。因变量为是否发生食物过敏（过敏赋值为1，非过敏赋值为0），自变量为rs2228055位点不同等位基因、食物过敏组和对照组儿童年龄，采用基于最大似然估计的向前逐步回归法，以0.05和0.10作为引入与剔除变量显著性标准。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、两组儿童一般资料比较食物过敏组患儿年龄4.2（0.1~15.0）岁，对照组年龄8.0（0.1~14.0）岁，组间比较差异有统计学意义（Z=-6.109，P<0.01）；食物过敏组男92例、女58例，对照组男86名、女64名，组间比较差异无统计学意义（χ2=0.497，P=0.481）。
二、两组儿童rs2228055位点基因型及等位基因频率分布    食物过敏组和对照组rs2228055位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=0.073、1.151，P=0.964、0.562）。食物过敏组患儿AG、GG基因型及等位基因G频率高于对照组患儿，差异有统计学意义；调整年龄因素后，两组间等位基因频率差异仍有统计学意义（P=0.017, OR=1.615, 95%CI 1.090~2.392），见表1。

三、rs2228055位点基因型及等位基因频率在过敏原特异性IgE阳性与阴性食物过敏患儿中的分布食物过敏组患儿过敏原特异性IgE阳性99例，阴性51例。rs2228055位点基因型及等位基因频率在过敏原特异性IgE阳性和阴性组分布：AA 49例（49.5%）、24例（47.1%）；AG 40例（40.4%）、22例（43.1%）；GG 10例（10.1%）、5例（9.8%）；A 138（69.7%）、70（68.6%）；G 60（30.3%）、32（31.4%）；两组间基因型及等位基因频率差异均无统计学意义（χ2=0.105、0.036，P=0.949、0.849）。四、rs2228055位点基因型及等位基因在不同临床表现的食物过敏患儿中的分布食物过敏组患儿中有皮肤表现的78例（主要表现为皮肤红斑、水肿、浸润、丘疹、渗出、结痂、鳞屑、干皮征、苔藓样变）、有消化系统表现的39例（主要表现为呕吐、反流、腹泻、便血）、有呼吸系统表现的78例（主要表现为流涕、打喷嚏、咳嗽、喘息），其中皮肤、消化系统和呼吸系统均累及的有3例，累及皮肤和消化系统的有11例，累及皮肤和呼吸系统的有16例，累及消化和呼吸系统的有6例。食物过敏组患儿中rs2228055位点基因型AA、AG、GG分别为73例、62例、15例。rs2228055位点基因型及等位基因频率在有皮肤表现和无皮肤皮肤表现患儿中分布：AA 37例（50.7%)、36例（49.3%)；AG 35例（56.5%)、27例（43.5%)；GG 6例（40.0%)、9例（60.0%)，A 109（52.4%）、99（47.6%）；G 47（51.1%）、45（48.9%），组间比较基因型及等位基因频率差异均无统计学意义（χ2=1.408、0.044，P=0.495、0.833）；rs2228055位点基因型及等位基因在有消化系统表现和无消化系统表现患儿中分布：AA 16例（21.9%)、57例（78.1%)，AG 19例（30.6%)、43例（69.4%)；GG 4例（26.7%)、11例（73.3%)；A 51（24.5%）、157（75.5%）；G 27（29.3%）、65（70.7%）；组间比较基因型及等位基因频率差异均无统计学意义（χ2=1.331、0.773，P=0.514、0.379）；rs2228055位点基因型及等位基因在有呼吸系统表现和无呼吸系统表现患儿中分布：AA 40例（54.8%）、33例（45.2%）；AG 33例（53.2%）、29例（46.8%）；GG 5例（33.3%）、10例（66.7%）；A 113（54.3%）、95（45.7%）；G 43（46.7%）、49（53.3%），组间比较基因型及等位基因频率差异均无统计学意义（χ2=2.360、1.471，P=0.307、0.225）。
五、rs2228055位点基因多态性对IL-10RA结构的影响
通过DS2018计算机软件，将IL-10RA第224位异亮氨酸虚拟突变为缬氨酸，其突变能为-0.08，IL-10RA的稳定性处于中性状态，稳定性没有增加。

讨论中国汉族人群IL-10RA外显子区域共有7个多态性位点，其中3个多态性位点能引起所编码的氨基酸改变，分别为rs2228055、rs2229113、rs1329514623[7]。国际人类基因组单体型图计划将最小等位基因频率大于0.05的多态性位点作为首要研究目标，最小等位基因频率较低的多态性位点需要较大的研究样本量，否则容易引起假阴性结果。上述3个位点中只有rs2228055位点最小等位基因频率大于0.05，且经过Hardy-Weinberg平衡检测符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，故选择其作为研究位点。1000 Genome数据库中该位点包含3个等位基因A、G和C，中国汉族人群只有等位基因A和G。本研究所纳入的人群只检测到等位基因A和G，有AA、AG、GG 3种基因型。
本研究发现食物过敏组儿童该位点基因型AG、GG及等位基因G频率高于对照组，提示该位点与食物过敏发病可能有相关性，携带等位基因G的儿童更容易发生食物过敏。该位点在正常中国汉族人口中等位基因G频率为0.26，本研究中食物过敏组患儿该位点等位基因G频率高于正常汉族人口，同时也高于对照组。该位点参与编码的氨基酸位于IL-10RA氨基酸序列第224位，非常靠近IL-10RA的细胞膜外部分与细胞膜接触的位置，当等位基因由A变为G后其所编码的氨基酸由异亮氨酸转变为缬氨酸[4]。计算机虚拟突变发现，当该位点所编码的氨基酸由异亮氨酸转变为缬氨酸后，IL-10RA的稳定性处于中性状态，稳定性没有增加。有文献报道异亮氨酸分子量大于缬氨酸，异亮氨酸带有一个甲基基团，因此异亮氨酸变为缬氨酸后，可能通过改变IL-10RA的结构而影响其功能[4]，导致IL-10不能有效地与其结合，影响IL-10生物学效应发挥。在下一步研究中可以通过构建不同等位基因的质粒进一步验证该位点等位基因改变对于IL-10RA结构及功能的影响。
食物过敏除了与遗传因素有关外，还与免疫、环境以及表观遗传学有关。随着年龄增长，一些患儿会对以前过敏的食物产生耐受[8]。Syed等[9]对花生过敏人群的研究发现，口服免疫治疗后Foxp3甲基化水平显著性降低。本研究为了尽可能减少表观遗传学等因素对研究的影响，对照组排除了既往有食物过敏病史但是入组时已经产生耐受的儿童。
食物过敏从发病机制上可以分为IgE介导和非IgE介导的食物过敏[10]。食物过敏原由抗原提呈细胞摄取、处理并由主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ类分子在其表面提呈，形成MHC-抗原肽复合物，CD4+T特异性地与该复合物结合形成抗原特异性CD4+T，在抗原刺激下，抗原特异性CD4+T大量增殖[11]。IL-10通过与Treg表面的IL-10R结合维持Treg转录因子Foxp3的表达促进Foxp3+Treg的产生，Foxp3+Treg可以抑制抗原特异性CD4+T增殖抑制过敏反应[3]。无论是IgE介导的食物过敏还是非IgE介导的食物过敏，都有抗原特异性CD4+T参与。如果IL-10RA结构发生改变，IL-10不能与Treg表面IL-10RA结合，Foxp3+Treg产生减少，Foxp3+Treg对抗原特异性CD4+T抑制作用减弱，促进食物过敏发生。
本研究发现rs2228055位点基因型及等位基因频率在过敏原特异性IgE阳性和阴性食物过敏患儿中分布差异无统计学意义，提示该位点可能在食物过敏反应早期，通过促进Foxp3+Treg产生抑制CD4+T增殖，抑制过敏反应发生。
食物过敏较常见的是累及皮肤、消化道和呼吸道[12]，这可能与淋巴细胞归巢（lymphocyte homing，LH）有关。LH指血液循环中的淋巴细胞选择性穿越毛细血管后高内皮微静脉，定向迁移并进入外周器官系统，其中定位在淋巴细胞表面，能够和相应组织血管内皮细胞表面黏附分子结合的分子称为淋巴细胞归巢受体（lymphocyte homing receptor，LHR)，能与LHR结合的血管内皮细胞黏附分子称为血管地址素[13]。不同的LHR和血管地址素决定淋巴细胞归巢到不同的器官系统。在不同的机体微环境下，不同性质抗原会诱导抗原特性CD4+T表达不同的归巢受体[14]。rs2228055位点编码氨基酸发生改变后可能引起Treg表面IL-10RA结构改变，IL-10不能与IL-10RA结合，Foxp3+Treg产生减少，对抗原特异性CD4+T抑制作用减弱[2]，抗原特异性CD4+T在消化道大量活化增殖，向不同器官系统归巢引起过敏反应。
本研究发现rs2228055位点基因型及等位基因频率在有皮肤表现和无皮肤表现、有消化系统表现和无消化系统表现、有呼吸系统表现和无呼吸系统表现的食物过敏患儿中分布差异无统计学意义，提示该位点对食物过敏反应的抑制作用可能是通过促进Foxp3+Treg产生，抑制抗原特异性CD4+T增殖实现的。
本研究对照组儿童年龄大于食物过敏组，主要因为本研究要进行外周静脉采血，对照组小年龄儿童因无疾病因素不愿进行静脉采血。二分类Logistics回归分析，调整年龄因素后，两组儿童等位基因频率差异仍有统计学意义，因而认为年龄不是影响两组儿童等位基因频率的因素。
综上，食物过敏组患儿IL-10RA外显子区域rs2228055位点基因型AG、GG及等位基因G频率高于对照组儿童，携带等位基因G的儿童更容易发生食物过敏。
志谢   广州市妇女儿童医学中心龚四堂教授对文章撰写提供的指导

参考文献（略）

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