头孢丙烯分散片(头孢丙烯国产口服制剂质量评价与生物等效性初步预测的研究)

头孢丙烯分散片
头孢丙烯国产口服制剂质量评价与生物等效性初步预测的研究
Quality assessment and bioequivalence primary prediction of
domestic oral dosage forms of cefprozil
作者
张斗胜，王   晨，于丽娜
王立新，刘春亮，胡昌勤
中国食品药品检定研究院
中国兽医药品监察所
滁州市食品药品检验中心
国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目（No：2015ZX09303001001）
摘要
目的：评价头孢丙烯国产口服制剂质量并初步预测生物等效性。
方法：采用HPLC 法分析原料及制剂的杂质谱变化，采用光纤探头与流通池法结合，模拟胃肠环境下，研究头孢丙烯片、分散片和胶囊的溶出曲线及溶出行为差异。
HPLC法：采用Alltima-C18 色谱柱（4.6mm×250mm，3.5 μm），柱温25 ℃，流速1.0 mL·min-1；有关物质测定时以0.23% 磷酸二氢铵溶液- 甲醇的为流动相，梯度洗脱，检测波长为225nm；溶出曲线实验时，以磷酸二氢铵溶液（称取磷酸二氢铵20.7 g．加水1 800 mL 使溶解，用磷酸调节pH至4.4）- 乙腈（90∶10）为流动相，检测波长为280 nm。
光纤溶出法：分别以水、介质1、介质2 为溶出介质，溶出体积900 mL，采用转篮法，转速为100 r·min-1，分别在4、8、10、30 min 时取样。
流通池法：以水、介质1、介质2 为溶出介质，温度37.0 ℃，流速4 mL·min-1，分别在3、6、10、15、30 min 时取样。
结果：国产头孢丙烯制剂中主要杂质为头孢羟氨苄，属工艺杂质；各剂型中头孢羟氨苄与总杂质控制较好，分别约含0.3% 和0.4% 左右；与专利药相比，无明显差异；国产头孢丙烯片具有与专利药相同的体外溶出行为；分散片和胶囊的体外溶出行为与片剂相似，无明显差异，表现为快速释放。
结论：头孢丙烯国产口服制剂质量较好，工艺较稳定；国产头孢丙烯片与专利药相比，药品质量无差异，体外溶出实验初步预测二者生物等效；而分散片和胶囊的快速溶出，对保证头孢丙烯的临床抗菌效果是有利因素。
关键词：头孢菌素；头孢丙烯；杂质谱；生理模拟介质；胃肠环境；生物等效性；体外溶出实验；体外替代方法；光纤溶出法；流通池法；HPLC 法
正文
头孢丙烯属第2 代头孢菌素，由于具有较长的半衰期和较高的生物利用度等药效和药动学特点，使其主要以口服剂型为主。
目前国产仿制头孢菌素口服制剂除国外药典收载的片剂、干混悬剂外，还包括分散片、咀嚼片、胶囊和颗粒剂，供临床使用。
面对众多国产仿制剂型，如何快速、有效评价不同剂型的质量优劣，是国家药品评价抽验工作的一项重要内容；而要客观评价仿制药与专利药的品质等同与否，关键是尽可能分析二者的生物等效性（体内实验或体外初步预测）；这也是目前口服药物评价研究面临的难点问题。
随着对人体与药物处置关系的认知深入，开发具有生物学意义的体外溶出实验，采用更接近人体生命特征的生物模拟介质，模拟在胃肠环境下，研究药物的处置过程，已越来越受到研究者的重视，特别是基于生物药剂学分类系统，开发特殊的体外溶出方法，用于初步预测生物等效性，是FDA、EMEA 等发达制药国家的管理部门认可的一种体外替代研究方法，也是药品评价的一种有效辅助手段。
鉴于此，本文以2013 年头孢丙烯制剂国家药品评价抽验工作为基础，首先研究头孢丙烯原料及制剂的杂质谱变化规律，对国产品与专利药的质量差异进行评价；
其次，采用体外溶出实验，以生理模拟介质作为生物等效性研究的体外替代方法，以中美上海施贵宝制药生产的头孢丙烯片（以下简称专利药）为参比制剂，分析国内临床常用的普通片、分散片和胶囊的体外溶出曲线与溶出行为差异，客观评价上述国产品与专利药的药品质量并初步预测生物等效性。
1
　材料与实验方法
1. 仪器
高效液相色谱仪：
Waters 2695 型（PDA 检测器、EMPOWER 工作站）；色谱柱：Alltima-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）。
溶出度仪：
FODT601RC 光纤探头溶出仪及FODT-601X 光纤探头药物实时测定仪（上海富科斯）；SOTAX CE7 Smart流通池溶出测试仪（美国SOTAX 公司）；RCA-8W溶出度试验仪及ZKT-7F 真空脱气仪（天津天大天发）。
2. 材料
盐酸、磷酸二氢铵、甲醇、氢氧化钠均为国产分析纯试剂（北京化工厂），乙腈为色谱纯（美国Fisher 试剂公司），SIF? Powder ORIGINAL 胃肠模拟介质（北美国Biorelevant 公司，批号01-1305-03），水为纯化水。
头孢羟氨苄（批号130431-201203）对照品、
头孢丙烯（批号130567-201203）对照品，
参比制剂头孢丙烯片（批号1205761，规格0.5 g·片-1，中美上海施贵宝制药有限公司），
头孢丙烯原料（南京亿华药业有限公司），174 批头孢丙烯口服制剂（普通片、分散片与咀嚼片规格0.25 g·片-1、0.5 g·片-1，胶囊规格0.25 g·粒-1，颗粒规格0.125 g·袋-1，干混悬剂规格0.25 g·袋-1、1.5 g·袋-1）均由中国食品药品检定研究院提供。
3. 试验方法
法定检验以及相关探索性研究主要采用中国药典2010 年版二部标准，其中杂质谱研究体外溶出实验等主要研究所用方法如下：
3.1 杂质谱研究
参照中国药典2010 年版二部头孢丙烯原料项下有关物质HPLC 法。
采用Alltima-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm），柱温25 ℃，流动相为0.23% 磷酸二氢铵溶液（A）- 甲醇（B），梯度洗脱（0~6 min，94%A；6~11 min，94%A → 91%A；11~15min，91%A → 89%A；15~30 min，89%A → 87%A；30~35 min，87%A → 80%A；35~40 min，80%A → 94%A），流速1.0 mL·min-1，检测波长为225 nm。
供试品以稀释溶剂［0.23% 磷酸二氢铵溶液（称取磷酸二氢铵2.3 g，加水溶解并稀释至1 000mL）- 甲醇（94∶6）］溶解并稀释成0.75 mg·mL-1 的溶液，进样20 μL 进行分析。
3.2 体外溶出实验
3.2.1  供试品溶液及生理模拟介质溶液的制备
取供试品适量，精密称定，照中国药典2010 年版二部头孢丙烯原料含量测定项下方法制备含头孢丙烯约为0.3 mg·mL-1 的溶液，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
药物在吸收进入血液循环前，首先经过胃肠运转；体内的生理环境（胃肠溶液）会影响药物的崩解释放；
因此，取SIF?powder ORIGINAL 胃肠模拟介质，在线计算（http：//biorelevant.com/fassif-fessif-fassgf-dissolutionmedia）配制模拟空腹条件下胃部的生理介质溶液：FassGF 溶液（pH=1.6）和模拟空腹条件下肠道的生理介质溶液：FassIF 溶液（pH=6.8），分别称为介质1、介质2；考察其对头孢丙烯溶出行为的差异化影响。
3.2.2　光纤溶出法参考USP 35-30 NF，分别以水、介质1、介质2 为溶出介质，溶出体积900 mL，采用转篮法，转速为100 r·min-1，分别在4、8、10、30min 时取样，参照中国药典2010 版二部头孢丙烯原料项下含量测定的HPLC 法测定；采用Alltima-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm），柱温25 ℃，以磷酸二氢铵溶液（称取磷酸二氢铵20.7 g，加水1 800mL 使溶解，用磷酸调节pH 至4.4）- 乙腈（90∶10）为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长为280 nm。
供试品以水溶解并稀释成0.3 mg·mL-1 的溶液，进样10 μL 进行分析。
另以上述溶出条件，以光纤探头，于280 nm 波长下测定透光率，采用标准曲线法绘制60 min 内的实时溶出曲线。
3.2.3　流通池法采用USP 35-DISSOLUTION<711>-Apparatus 4（Flow Through Cell）装置，即流通池法,以水、介质1、介质2 为溶出介质，温度37.0 ℃,流速4 mL·min-1，分别在3、6、10、15、30 min 时取样，参照中国药典2010 年版二部头孢丙烯原料项下含测HPLC 法测定并计算累积溶出率。
3.3 数据统计与分析
杂质谱研究所涉及数据统计与分析主要采用国内外主流数据统计软件完成，包括JPM-SASS9.0 教育版（美国SASS 公司），中药色谱指纹相似度软件2004A（国家药典委员会）。
生物相似性体外溶出相关数据统计与分析主要采用 Excel 2003 版（美国Microsoft 公司）完成。
2
加速试验
取头孢丙烯原料适量，照中国药典2010 年版二部 头孢丙烯原料有关物质检查项下方法制备含头孢丙烯约为0.75 mg·mL-1的溶液，作为储备液。
分别取储备液各约5 mL，分别置于10 mL 量瓶中，按下述方法进行加速试验。
1. 酸降解
加入0.1 mol·L-1盐酸溶液0.1 mL，摇匀，置50℃水域加热10 min 放至室温后，加入0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液0.1mL 中和，备用。
2. 碱降解
加入0.1 mol·L-1 氢氧化钠溶液0.1 mL，摇匀，置50 ℃水域加热10 min 放至室温后，加入0.1 mol·L-1盐酸溶液0.1 mL 中和，备用。
3. 氧化降解
加入双氧水0.1mL，摇匀，室温放置5~10 mim，备用。
4. 高温降解
置90 ℃水浴加热10 min，放至室温，备用。
取上述各加速实验样品溶液，用0.45 μm 微孔滤膜滤过；各取续滤液1 mL，分别用稀释溶剂稀释成0.5 mg·mL-1 的溶液进行HPLC 分析。
3
结果与讨论
1. 杂质谱研究
药物及制剂中杂质的变化，与原辅料质量、工艺处方及生产过程控制等因素密切相关，是最能真实反映出产品间质量优劣的一项重要指标。
因此本文首先对头孢丙烯原料及口服制剂中杂质的变化与上述因素开展相关性研究，即杂质谱研究，来评价国产不同口服头孢丙烯剂型间的质量优劣。
1.1 试验方法的确定
统一采用中国药典2010 年版头孢丙烯原料有关物质检查项下方法（同USP 35-NF 30 版）对头孢丙烯各制剂进行杂质谱研究。
1.2 杂质来源与归属
以174 批样品HPLC 色谱数据为模板，输入中药色谱指纹相似度软件（国家药典委员会），所有杂质按保留时间编号拟合头孢丙烯色谱分析模拟色谱图，见图1。
   1：杂质1（impurity1）2：杂质2（impurity2）
   3：杂质3（impurity3）4：杂质4（impurity4）
   5：杂质5（impurity5）6：杂质6（impurity6）
   7：杂质7（impurity7）8：杂质8（impurity8）
   9：杂质9（impurity9）10：杂质10（impurity10）
图1　头孢丙烯有关物质模拟色谱图
由图1 可知，现行HPLC 法检测国产头孢丙烯制剂总杂质数为10 个。
进一步取头孢丙烯原料，按“3”项方法进行加速试验。
综合HPLC-PDA 光谱和加速试验结果，初步确定目前头孢丙烯制剂中杂质来源，详见表1。
表1　图1 中杂质来源与归属
注（note）：以头孢丙烯Z 异构体计算相对保留时间
由表1 可知：现行HPLC 法检测国产头孢丙烯制剂的10 个杂质中，1、2 号杂质为辅料，3 号杂质为氧化杂质，4 号杂质为工艺杂质- 头孢羟氨苄；6、7 号杂质为头孢丙烯Z、E 异构体，其他杂质为未知杂质。
1.3  不同原料来源对制剂的影响
调研发现目前国产头孢丙烯口服制剂用原料来自国内3 家生产厂。
分别按剂型挑选来自3 家不同原料厂的多批次样品，采用中国药典2010 年版头孢丙烯原料有关物质检查项HPLC 法测定有关物质，实验结果显示：原料对头孢丙烯制剂生产基本无影响。
制剂中主要杂质头孢羟氨苄可能为原料带入；目前国产头孢丙烯原料中头孢羟氨苄控制在0.2%左右。
1.4  不同企业间制剂中有关物质分析
分别以抽验涉及厂家、剂型对174 批次样品的有关物质检查结果按特定杂质、其他单个杂质和其他杂质总和进行统计作表来进一步分析不同企业的头孢丙烯制剂间杂质分布情况，结果见表2。
表2　不同厂家间杂质分布表

表2 结果显示：抽样15 家制剂企业的174 批次产品中，特定杂质—头孢羟氨苄杂质在干混悬剂中的检出水平较高，最大检出值在0.5% 左右；除头孢羟氨苄外，其他单个杂质和其他杂质总和在0.2%~0.3%之间；且不同厂家间、不同剂型间检出水平比较接近。
综合统计，头孢羟氨苄杂质检出均值在0.3% 左右，总杂质在0.4% 左右，与专利药（中美上海施贵宝制药有限公司）相比，无明显差异。
结果表明：国产头孢丙烯制剂间质量无明显差异，总体质量控制较好，工艺较稳定。
2. 生物等效性初步预测研究
2013 年头孢丙烯制剂国家药品评价抽验借鉴国际新的体外溶出实验理念与方法，采用反映人体生理、年龄等因素变化的胃肠模拟液模拟胃肠环境下，同时以光纤溶出测定法和流通池法测定国产制剂与参比制剂的体外溶出曲线。
通过与专利药的比较以及体外溶出与模拟生物溶出的相关性分析，进一步评价临床常用国产头孢丙烯片、分散片和胶囊的质量，并初步预测生物等效性。
2.1  HPLC 法与光纤溶出法测定样品的溶出值的比较
采用“1.3.2.1”项方法测定参比制剂，HPLC 检测结果与光纤溶出法测定溶出量比较见表3。
表3　HPLC 与光纤溶出法测定溶出结果比较
表3 显示两方法测定结果基本无差异，即光纤探头测定溶出结果准确可信。
2.2  光纤溶出法测定头孢丙烯片、分散片与胶囊的溶出曲线比较
采用“1.3.2.1”项下方法测定样品，60 min 内不同厂片剂、分散片、胶囊与参比制剂在水中的实时溶出曲线结果见图2~4。

参比制剂（reference preparation/batch：1205761）　
厂家1（manufacturer 1/batch：12122111）　
厂家2（manufacturer 2/Batch：130305）　
厂家3（manufacturer 3/batch：12122103）　
厂家4（manufacturer 4/batch：130101）　
厂家5（manufacturer 5/batch：20813601）
图2　光纤法测定头孢丙烯片的溶出曲线
厂家6（manufacturer 6/batch：20130012）　
厂家7（manufacturer 7/batch：130108）
图3　光纤法测定头孢丙烯分散片的溶出曲线
厂家8（manufacturer 8/batch：208027N3）　
厂家9（manufacturer 9/batch：C12016）
图4　光纤法测定头孢丙烯胶囊的溶出曲线
由图2~4 可知：1~5 号厂家的国产头孢丙烯片的体外溶出曲线与专利药（中美上海施贵宝制药有限公司）相一致，6 号厂家在4 min 溶出量稍低于专利药及其他厂家，但溶出量也达80%，溶出曲线仍与专利药相一致。
对比图2~4 可知：分散片的体外溶出曲线与片剂稍有差异，主要表现为前4 min 的溶出差异，即分散片的释放溶解较片剂稍缓，平均值在70% 左右，而在8 min 后溶出曲线变化与片剂基本相同。
胶囊的体外溶出曲线与片剂相比，在前10 min 较为明显，受胶囊破壳的影响，头孢丙烯释放溶出整体较片剂（4 min 左右）向后延迟4~5 min，在10 min 后溶出达饱和，溶出曲线变化与片剂趋于一致。
上述结果显示：头孢丙烯制剂在短时间内均快速溶出，如以FDA 推荐快速溶解的定义为“10 min 内溶出达85% 以上”衡量，国产头孢丙烯片、分散片、胶囊可归为速释剂型。
从整体看，3 种剂型的体外溶出曲线具有相似的变化趋势；但片剂、分散片与胶囊间在前10 min 的溶出差异是否对药物在体内释放有影响仍需要进一步确认。
2.3　生物药剂学分类的探讨
目前，国际生物药剂学分类有2 种体系，即BCS和BDDCS 分类。
BDDCS 分类除考虑药物固有的理化性质如吸收性和渗透性外，还进一步考虑了药物的体内转运和代谢过程。
已有文献指出头孢菌素如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定以及头孢丙烯等在体内的吸收主要经过肠上皮细胞寡肽转运蛋白Pept1 介导的主动转运机制进入血液循环；
同时有关药代动力学文献显示：不同剂型中的头孢丙烯在体内均以原药形式经肾随尿液排出体外，表明头孢丙烯在体内处置未发生代谢反应。
综合体外溶出试验与文献报道药代动力学特性，推测头孢丙烯可能属于BDDCS-Class3（高溶解，弱转运/ 弱代谢）药物。
2.4　头孢丙烯渗透性的影响程度推导
虽然文献证实头孢丙烯的吸收机制为Pept1 蛋白介导主动转运，但确切的渗透性测定值未见报道。
利用药物的生理性质与其结构紧密相关的特点，对头孢丙烯渗透性的影响程度进行了推导。
对文献已报到31 种已知Pept1 亲和程度的β-内酰胺抗生素进行结构比较，发现头孢羟氨苄与头孢丙烯的化学结构非常相似，见图5。
图5　头孢羟氨苄与头孢丙烯化学结构式
分析图5 可知：两化合物结构主要区别在于3 位由丙烯基取代甲基。
而头孢菌素结构中与Pept1 亲和力密切关联的结构域为内酰胺环的α- 氨基酸结构和7 位苯甘氨酸酚羟基结构（类氨基酸结构）。
图5 显示两化合物的特征结构域完全相同，头孢丙烯中3 位丙烯基取代并未影响结构域功能，还更好地保护邻位羧基不受水解。
进一步采用比较分子场计算结构最优势能，结果显示二者具有相似的最优空间状态。
从结构域以及空间构向与能量分析推导头孢丙烯与Pept1 蛋白结合的亲和性与头孢羟氨苄相似，属低亲和性底物（>5 mmol·L-1）。
结果提示：渗透性因素可能影响头孢丙烯的吸收，因此采用生理介质条件下体外溶出实验更能反映出制剂的内在品质。
2.5　生物相似性溶出介质结合流通池法（开放式）分析头孢丙烯片、分散片和胶囊的体内外溶出行为差异
根据供试品的BDDCS-Class3 特征，采用生物相似性溶出介质结合流通池法来模拟药物在体内的释放行为，评估上述3 种制剂0.5 g·片-1的释放行为是否受生理介质影响而产生差异变化。
3 种制剂依次通过流通池，在水及模拟胃人体胃肠道环境中的2种介质（介质1 和介质2）下测定的累积溶出曲线见图6~8。

介质（media）：水（water）　1.参比制剂（reference preparation/batch：1205761）2. 厂家2（manufacturer 2/batch：130305）　3. 厂家5（manufacturer 5/batch：20813601）
图6　流通池法（开放式）测定国产头孢丙烯片的累积溶出曲线

介质1　（media 1） 1. 参比制剂（reference preparation/batch：1205761）　
2. 厂家6（manufacturer 6/batch：20130012）　3. 厂家7（manufacturer 7/
batch：130108）
图7　流通池法（开放式）测定国产头孢丙烯分散片的累积溶出曲线
介质2　（media 2）　1. 参比制剂（reference preparation/batch：1205761）
2. 厂家8（manufacturer 8/batch：208027N3）　3. 厂家9（manufacturer 9/
batch：C12016）
图8　流通池法（开放式）测定国产头孢丙烯胶囊的累积溶出曲线
比较以上溶出曲线图发现：头孢丙烯片、分散片和胶囊在模拟人体胃肠环境下的生物相似溶出曲线与光线探头测定的体外溶出曲线（图2~4）基本相似；片剂与分散片的测定结果更为接近，胶囊的溶出稍有差异，即胶囊的破壳会延迟药物释放。
结果显示：不同溶出介质中，头孢丙烯片、分散片和胶囊与参比制剂呈相似的溶出行为，即均在10 min 内都达到溶出饱和（≥ 85%）；同时上述3 种剂型在模拟胃肠环境下的溶出曲线与体外溶出度测定用介质- 水中的溶出曲线非常相似，无明显差异；即胶囊的破壳并未受人体胃肠道生理环境影响。
从其结果可推测：目前国产头孢丙烯口服制剂中辅料、工艺对其在体内的溶出行为基本无影响；即头孢丙烯制剂在前10 min内的体外溶出差异并不影响其在体内的释放。
根据所含主成分相同，剂型与规格相同，所用辅料不影响制剂的崩解释放等模拟体外溶出实验结果，初步预测国产头孢丙烯片与专利药生物等效。
另从药效学角度看，头孢菌素作为时间依赖型抗生素，避免溶出成为吸收的限速步骤是口服剂型研发考虑的一项重要因素；因此头孢丙烯分散片和胶囊的快速溶出特点，对保证头孢丙烯的临床抗菌效果是有利因素。
4
小结
本文提出采用杂质谱、模拟人体胃肠道体外溶出曲线来综合评价头孢丙烯口服制剂的药学质量。
实验结果显示：国产头孢丙烯制剂质量较好，工艺较稳定；生物相似性溶出试验，初步预测国产头孢丙烯片与专利药生物等效，而分散片和胶囊表现为快速溶出，对保证头孢丙烯的临床抗菌效果是有利因素。
上述研究为进一步研究优化头孢丙烯口服制剂的工艺提供技术基础；其研究思亦为其他药品的再评价研究提供参考和借鉴。

说明
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http://pan.baidu.com/s/1hrDKpyG
来源：药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2016,36(6)
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